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　　實驗名稱：超聲激活血卟啉對S180腫瘤細胞表(biao)面EGFR表(biao)達(da)量(liang)的影響

　　研(yan)究(jiu)方向：生物醫療

　　測試目的：

血卟啉是從血紅蛋白中提取(qu)的(de)(de)有機光(guang)敏(min)劑，其本身無抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)效應，但它可以在(zai)(zai)動物和人的(de)(de)多種腫(zhong)(zhong)瘤(liu)組(zu)織優(you)先聚集，易為(wei)(wei)聲(sheng)(sheng)光(guang)輻(fu)射處理(li)激活(huo)，當它被聲(sheng)(sheng)光(guang)激活(huo)后能產生(sheng)強烈(lie)的(de)(de)抗腫(zhong)(zhong)瘤(liu)效應。美(mei)國利用光(guang)激活(huo)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)(liao)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)，這種方法(fa)被稱(cheng)為(wei)(wei)光(guang)動力(li)學療(liao)(liao)(liao)(liao)法(fa)，簡稱(cheng)PDT。光(guang)動力(li)學療(liao)(liao)(liao)(liao)法(fa)在(zai)(zai)臨床主(zhu)要應用于人體表(biao)面淺層腫(zhong)(zhong)瘤(liu)的(de)(de)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)(liao)。光(guang)在(zai)(zai)生(sheng)物組(zu)織中的(de)(de)穿透能力(li)差，使其對深部腫(zhong)(zhong)瘤(liu)的(de)(de)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)(liao)受到限制(zhi)。超聲(sheng)(sheng)聯合血卟啉對小(xiao)鼠移植腫(zhong)(zhong)瘤(liu)生(sheng)長抑制(zhi)有協同(tong)效應(ying)，發現(xian)單(dan)用(yong)血卟啉(lin)無抑(yi)(yi)制作(zuo)用(yong)，單(dan)用(yong)超聲僅有(you)(you)輕微抑(yi)(yi)制作(zuo)用(yong)，而兩者(zhe)聯(lian)合則有(you)(you)明顯(xian)的(de)抑(yi)(yi)制效果，并將之命名(ming)為(wei)聲動力(li)學(xue)療(liao)法。超聲是一種彈性機械波，其在生物組(zu)織中的(de)穿透(tou)能力(li)比激(ji)光強，同(tong)時超聲能夠聚焦于特(te)定部位。聲動力(li)療(liao)法對(dui)于治療(liao)腫(zhong)瘤(liu)(liu)細胞有(you)(you)較強的(de)針對(dui)性，對(dui)正常組(zu)織無創傷，組(zu)織穿透(tou)力(li)強，并且機體不產生耐受性，可以(yi)反復多(duo)次(ci)治療(liao)，因而它(ta)對(dui)于治療(liao)腫(zhong)瘤(liu)(liu)，特(te)別是組(zu)織深層腫(zhong)瘤(liu)(liu)有(you)(you)著較好的(de)應(ying)用(yong)前景。有(you)(you)學(xue)者(zhe)認為(wei)SDT殺(sha)死或抑制腫瘤細胞的(de)部分機理是通過超聲的(de)熱效應來實(shi)現的(de)，但是大(da)量的(de)實(shi)驗結果提示，SDT可能更主要地與超聲激活(huo)聚集(ji)在(zai)癌組織(zhi)的血卟啉產生單線態氧有關。

　　測試設備：ATA-8202射頻功率放(fang)大器、昆明系小(xiao)白(bai)(bai)鼠(shu)、艾氏(shi)腹水(shui)腫瘤細胞系、超聲探頭、血卟啉(lin)衍(yan)生物為單(dan)(dan)羥乙基(ji)單(dan)(dan)乙烯基(ji)次(ci)卟啉(lin)、細胞色素(su)c和Bax單(dan)(dan)克隆抗體(ti)、caspase-3單(dan)(dan)克隆抗體(ti)、鏈霉(mei)卵白(bai)(bai)素(su)SP試劑盒。

　　實驗(yan)過程：

　　接(jie)種：S180腹(fu)(fu)水瘤細胞(bao)于6只(zhi)小鼠腹(fu)(fu)腔1周后，隨機取3只(zhi)小鼠，抽取(qu)腹水細胞，分別置于醫(yi)用薄壁試管，加入RPMI1640+10%小(xiao)牛血(xue)清培養(yang)基中，于37℃孵箱培養(yang)，實驗(yan)時用生理鹽水調整(zheng)細(xi)胞濃(nong)度至2x10⁶個(ge)/ml。每只(zhi)小鼠抽取的腹水細胞分為(wei)12管(guan)，分為四組，分別為對照(zhao)組(CT)、血卟啉(lin)組(H)、超(chao)聲組(U)和超(chao)聲加血卟啉組(UH)，每組三管，每管0.5ml細(xi)胞懸液。H組和UH組每(mei)管中加入血卟啉4ul，使其終濃度為(wei)0.01mg/ml，37℃CO₂孵箱孵育(yu)，45min后U組(zu)和UH組(zu)分別在頻率為1.8MHz，強度(du)為2W/cm²的超聲(sheng)(sheng)裝置中聲(sheng)(sheng)照(zhao)處理3min，各實(shi)驗組分別于聲照后1h、3h、5h取材，常規細(xi)胞(bao)涂片(pian)。

　　免疫組織化(hua)學染色：以SP法進(jin)行(xing)免疫組織化學染(ran)色：細胞涂片固定(ding)后(hou)加3%過氧(yang)化氫處理15min，除去(qu)內源(yuan)性酶PBS洗(xi)3次，加(jia)正(zheng)常動物血清(qing)30min以(yi)減(jian)少非特異(yi)性染(ran)色，加(jia)EGFR一(yi)抗4℃過(guo)夜，PBS代(dai)替(ti)一抗(kang)作為陰性(xing)對(dui)照(zhao)。SP染(ran)色按試劑(ji)盒說明(ming)進(jin)行，DAB顯色，梯度(du)酒精脫水，中(zhong)性樹膠封固蓋片。

　　陽性(xing)結果觀(guan)察：各(ge)組隨機(ji)選(xuan)取(qu)10個(ge)高倍視野(ye)，利用數碼顯微(wei)成像(xiang)系統(tong)進行圖像(xiang)采集和分(fen)析。Image Pro-Plus5.0圖(tu)像(xiang)分析軟件(jian)測定各組照片的(de)平均(jun)(jun)光密(mi)度OD值(0~255)(用平均(jun)(jun)光密(mi)度表示陽(yang)性細胞表達強度，平均(jun)(jun)光密(mi)度值越(yue)大則表達越(yue)強)。組間(jian)t檢驗顯(xian)示組間(jian)差異(yi)。

　　實驗結果(guo)：

　　由表中數(shu)據可以看出，超聲激活血卟啉處理(li)1h后(hou)，UH組(zu)(zu)(zu)、U組(zu)(zu)(zu)平均光密度值明顯低于(yu)CT組(zu)(zu)(zu)、H組(zu)(zu)(zu)，且UH組(zu)(zu)(zu)平均光密度值低于(yu)U組(zu)(zu)(zu)，經組間(jian)t檢驗(yan)，UH組(zu)與其它組(zu)差異極顯著(p<0.01)；超(chao)聲激(ji)活血卟啉處(chu)理3h后，UH組(zu)平均光密(mi)度值小幅度下降，CT組(zu)、H組(zu)基(ji)本無(wu)變(bian)化，U組平均光密(mi)度下降，經組(zu)間t檢驗，UH組(zu)與可組(zu)差(cha)異(yi)顯著(zhu)(P<0.05)；UH組與(yu)CT組、H組差異極顯著(p<0.01)；超聲(sheng)激活(huo)血卟啉(lin)處理5h后，UH組平均光密(mi)度值下降，其(qi)它(ta)組基本無變化(hua)，UH組與其(qi)它(ta)組差(cha)異(yi)極顯著(p<0.01)(表1)。由圖(tu)可知，UH組(zu)、U組(zu)平均(jun)光密(mi)度值明(ming)顯(xian)低于H組(zu)和CT組(zu)，隨時間延長U組(zu)、UH組(zu)變化顯(xian)著。

　　表1EGFR在超聲處(chu)理1h、3h、5h后平均(jun)光(guang)密(mi)度(du)值比(bi)較(*10^-2)

　　圖1EGFR在(zai)超聲處(chu)理1h、3h、5h后平均光密度(du)值比(bi)較(*10^-2)

　　安泰ATA-8202射(she)頻功率放(fang)大器：

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