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　　實驗名稱：聲(sheng)化(hua)學誘導艾氏(shi)腹水瘤細(xi)胞凋亡機制初探

　　研究方向：生物醫學

　　測試(shi)目(mu)的：

　　聲(sheng)動力(li)學療(liao)法(Sonody namic therapy，SDT)是利用超聲(Ultrasound，Us)具有(you)深部穿透及準確(que)聚(ju)焦于生(sheng)物組織局部的能力，激活相對無(wu)毒并且能在腫瘤細胞中(zhong)特異(yi)性富集(ji)的聲敏劑分子血卟啉衍(yan)生物，產生具有高氧(yang)化活性(xing)的單線(xian)態氧(yang)等(deng)自由基，能有效地殺腫瘤細胞從而治療癌癥的新方法。

　　學者主要提出超聲空化效應、單(dan)線(xian)態氧(yang)理(li)論(lun)、自由(you)基理(li)論(lun)等，但聲動力學(xue)療法對(dui)腫瘤細(xi)胞作用的生物學(xue)機制仍不清楚。在超聲激活血卟啉殺傷癌細(xi)胞的研究中，通過掃描電(dian)鏡、透(tou)射(she)電(dian)鏡以及PI-HO和(he)Annexin V-PI熒光雙染(ran)，觀察受損后細胞形態結(jie)構的變化，曾發(fa)現(xian)處理后的S180和(he)艾氏(shi)腹水腫瘤細(xi)胞(bao)(EAT)有核(he)物質凝集(ji)、趨邊(bian)排列(lie)以及(ji)凋亡小(xiao)體(ti)的形成等(deng)細(xi)胞(bao)凋亡特征，提(ti)示聲動力學療(liao)法不僅能直(zhi)接殺(sha)傷(shang)腫瘤細胞(bao)，還可通過誘導腫瘤細胞凋亡來(lai)治療(liao)癌(ai)癥。前期聲(sheng)動(dong)力學療(liao)法抗(kang)癌(ai)的形態學研究發現，線粒體是較為敏感易變的細胞器之(zhi)一，它不僅是細(xi)胞的能(neng)量代謝(xie)中心，氧自(zi)由基的重要產生部(bu)位，而且與(yu)脊椎動物細(xi)胞凋亡的調控密切相關。本實驗采(cai)用頻率為1.43MHz，聲(sheng)強為3.0W/cm²的(de)高頻聚焦超聲和濃(nong)度為(wei)0.025mg/ml的(de)血卟啉處理艾(ai)氏腹水腫瘤細胞，通過(guo)檢測3種促凋亡蛋白的表達(da)、超氧化物歧化酶的活性(xing)以及膜脂(zhi)質過(guo)氧化物的含量，研(yan)究超聲激活血卟啉誘導艾(ai)氏腹水瘤細胞的凋亡機制及其與氧(yang)自由基的關系。

　　測試設(she)備：ATA-M110高頻(pin)功(gong)率(lv)放大器模塊、昆明系(xi)(xi)小白鼠、艾氏腹(fu)水腫瘤細胞系(xi)(xi)、超聲(sheng)探頭、血卟(bu)啉衍生物為單(dan)羥(qian)乙基單(dan)乙烯基次卟(bu)啉、細胞色素c和Bax單(dan)克隆抗體(ti)、caspase-3單(dan)克隆抗體(ti)、鏈霉卵(luan)白素SP試劑盒。

　　實驗過(guo)程：

　　接種艾氏腹(fu)水(shui)腫瘤(liu)細(xi)胞于10只小(xiao)鼠腹(fu)腔(qiang)1周后，隨機取5只(zhi)小鼠(shu)(其余5只(zhi)備用)，抽取腹水細胞，分別(bie)置于醫用薄壁試管(含RPMI 1640+10%小牛血(xue)清培養基)，于37℃CO₂孵箱培養。實驗(yan)時用生理鹽水調整細胞濃(nong)度至3×10⁶cells/ml。每只(zhi)小鼠抽取的腹水(shui)細胞再分為4管(guan)，每管0.5ml細胞懸液，分別設為對照(zhao)組(CT)、血(xue)(xue)卟啉組(H)、超聲(sheng)組(Us)和超聲(sheng)加血(xue)(xue)卟啉組(UH)。H組和UH組每管中加入(ru)血(xue)(xue)卟啉5μl，使其(qi)終(zhong)濃度(du)為0.025mg/ml，37℃CO₂培養箱孵育45min，Us組和UH組分別在頻率為(wei)1.43MHz，強(qiang)度為3.0W/cm²的超(chao)聲裝置(zhi)中聲照處理(li)3min。各(ge)實驗組分別于不同時(shi)間(jian)段取材處理(li)。實驗重復3次，以(yi)確認(ren)實(shi)驗結(jie)果的穩定(ding)性。

　　免(mian)疫細胞化(hua)學(xue)檢測Bax，細胞色素c，caspase-3蛋(dan)白表達各(ge)實驗組分(fen)別(bie)于超(chao)聲處理后0h，1h，3h取材。常(chang)規細胞(bao)涂片(pian)，丙酮固(gu)定10min，PBS洗滌3次，每(mei)次5min；含(han)0.3%TritonX-100的PBS處理10min，以(yi)增加膜通透(tou)性，PBS洗(xi)滌3次，每(mei)次5min；0.3%H₂O₂-甲醇(chun)于(yu)37℃處理15min，封閉內源(yuan)性過氧化物(wu)酶，PBS洗滌3次，每(mei)次5min；正常山(shan)羊血清于(yu)37℃封閉30min，封閉非特(te)異性結合位點；分別滴加抗(kang)Bax、細胞色素c和caspase-3單克隆(long)抗(kang)體(1∶100，1∶50，1∶500)，4℃孵育過夜，陰(yin)性對照(zhao)組以(yi)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗(kang)；加入的二抗(kang)為生物(wu)(wu)素標記羊抗(kang)兔IgG或(huo)生物(wu)(wu)素標記羊抗(kang)小(xiao)鼠(shu)IgG，室溫孵育1h，PBS洗(xi)滌3次，每(mei)次5min；滴加辣(la)根(gen)酶標記鏈酶卵(luan)白素工作液，室溫(wen)孵育(yu)1h，PBS洗滌3次，每次(ci)5min；DAB顯色，梯(ti)度酒(jiu)精(jing)脫水(shui)，中性樹膠封(feng)固(gu)蓋片。

　　實驗結(jie)果：

　　根據(ju)免(mian)疫細胞化學光鏡觀察(cha)結果和兩因素重復測(ce)量方差分(fen)析可(ke)見(jian)，不同(tong)處理方法對Bax，細胞色素c和caspase-3蛋白有極顯著(zhu)影響，不同取材時間對這三種凋亡蛋白(bai)亦(yi)有極顯著影(ying)響(xiang)。Tukey HSB法多重比較顯示：0h時各(ge)實(shi)驗組之間(jian)無(wu)顯著性(xing)差異(P>0.05)；處理1h時，UH組的3種(zhong)促凋亡蛋(dan)白(bai)表達均高于(yu)其它3個處理(li)組(U，H和CT組)，差異極顯(xian)著(P<0.01)；3h時，U組(zu)和(he)(he)UH組(zu)3種蛋白表(biao)達均比CT組(zu)和(he)(he)H組(zu)高，差(cha)異極顯著(P<0.01)，UH組(zu)的蛋白表達高(gao)于U組(zu)，差異極顯著(P<0.01)。而3種(zhong)促凋(diao)亡蛋白(bai)表達的時(shi)滯效應分(fen)析結果也表明：各實驗組中CT和H組的3種促凋亡(wang)蛋白(bai)隨時間延(yan)長表達量(liang)無顯著變化；U組(zu)的蛋白表達量在處理3h時顯著(zhu)升(sheng)高；UH組的(de)蛋白(bai)表達(da)量隨時間(jian)延長持續升高(gao)(平均光(guang)密度(du)值表示陽性細胞蛋白(bai)表達(da)強度(du)，平均光密度(du)值越小則表達信號越強)。

　　EAT細(xi)胞中SOD活力和MDA水平測定(ding)結果，超聲+血卟啉處(chu)理(li)EAT細胞后(hou)1h取材，發現與CT和H組相比，U組的SOD活力略有降低，但不顯著(P>0.05)，細胞膜脂質過氧(yang)化(hua)水平無顯著變化(hua)(P>0.05)，UH組的SOD活力顯著降低，細胞膜(mo)脂(zhi)質(zhi)過(guo)氧(yang)化水平顯著升高。(P<0.01)

　　表(biao)1：Tukey HSB法對不同取材時間Bax、細(xi)胞(bao)色素(su)c和caspase-3平(ping)均光密度值(×10^-4)的(de)多重比較

　　圖1：不同時間段取材各組Bax蛋白平均光密度值變化

　　圖2：不同時(shi)間段取(qu)材各組細胞(bao)色素(su)c蛋白平均(jun)光密度值變化

　　安泰ATA-M110高頻(pin)功率放大器模塊(kuai)：

本文實驗(yan)素材(cai)由(you)西安(an)安(an)泰(tai)電(dian)子(zi)整理(li)發(fa)布。Aigtek已經成為在業界擁有廣泛(fan)產(chan)品線(xian)，且具(ju)有相當規模的(de)儀(yi)器(qi)設備供應(ying)商，樣機(ji)(ji)都支持(chi)(chi)免費試(shi)用。西安(an)安(an)泰(tai)電(dian)子(zi)是專業從事功率放大(da)(da)(da)器(qi)、高(gao)壓(ya)放大(da)(da)(da)器(qi)、功率信號源(yuan)、前置(zhi)微小信號放大(da)(da)(da)器(qi)、高(gao)精度電(dian)壓(ya)源(yuan)、高(gao)精度電(dian)流源(yuan)等電(dian)子(zi)測(ce)量儀(yi)器(qi)研發(fa)、生產(chan)和銷售(shou)的(de)高(gao)科技企業。公司致力(li)于功率放大(da)(da)(da)器(qi)、功率信號源(yuan)、計量校準源(yuan)等產(chan)品為核心的(de)相關(guan)行業測(ce)試(shi)解決方案的(de)研究，為用戶提供具(ju)有競爭力(li)的(de)測(ce)試(shi)方案，Aigtek已經成為在業界擁有廣泛(fan)產(chan)品線(xian)，且具(ju)有相當規模的(de)儀(yi)器(qi)設備供應(ying)商，樣機(ji)(ji)都支持(chi)(chi)免費試(shi)用。如(ru)想了解更(geng)多功率放大(da)(da)(da)器(qi)等產(chan)品，請持(chi)(chi)續關(guan)注安(an)泰(tai)電(dian)子(zi)官網www.aigtek.com或撥打029-88865020。